小鼠肝类器官构建、传代、分化流程

原代构建、传代、分化的肝类器官形态（标尺=500 μm）如图 1 所示

图 1：使用MasterAim®小鼠肝类器官完全培养基/分化试剂盒构建的小鼠肝类器官

P0D1：一只小鼠的肝脏组织处理后可接种 20-25 个胶滴（约 20w cells 接种一个胶滴）；

P0D3：原代细胞接种后存活良好且增殖效率高，在第3天开始出现空泡状的肝细胞类器官；

P0D7：可见明显的空泡状的类器官，大的空泡直径可达 500 μm，且大的空泡周围有变黑趋势，可以传代（一般P0代在培养 5-7 天时可传代）；

P1D5：传代后类器官密度增大，背景更干净，无其他细胞。

分化后D0-D15：空泡状的小鼠肝类器官内部越来越多向黑色实质转变，整体上黑色实质状类器官团增多，此时类器官尽快进行实验（建议实验时间窗口为 2-3 天），不可进行传代和冻存。

图 2：使用MasterAim®小鼠肝类器官完全/分化培养基构建的小鼠肝类器官



图 3：小鼠肝祖细胞类器官生长曲线

原代构建及传代后小鼠肝类器官形态（标尺：500 μm）如图 2 所示：

P0：一只小鼠的肝脏组织处理后可以接种 20-25 个胶滴（推荐接种密度：约4000 cells/μL，50 μL/孔）；持续培养至第6天，空泡类器官体积逐渐增大；可见500 μm 左右的类器官形成，镜下呈空泡结构，边缘光滑、随着类器官体积增大，部分类器官可出现褶皱并伴随裂解，此时需要尽快传代；

P1-P5：类器官以空泡结构为主，并具有少量实心球结构，直径在200-500 μm，传代后形态与传代前保持一致，且能稳定增值传代，可长期稳定培养（图3）。

分化前的小鼠肝类器官的鉴定数据



图 4 ：分化前的小鼠肝类器官的HE&免疫组化鉴定结果



图 5 ：分化前的小鼠肝类器官免疫荧光鉴定结果

如图 4，图 5 所示，对分化前的小鼠肝类器官进行免疫组化染色（图 4 ）和免疫荧光染色（图 5 ）鉴定相关标志物表达情况，结果显示，分化前的小鼠肝类器官具有多种形态，包括薄壁及厚壁的空心状类器官及部分实心状类器官，且这些类器官中的细胞处于增殖活跃期（Ki67+），EPCAM+，E-cadherin+（上皮细胞标志物），CK19+（肝胆导管上皮特异性标志物），部分细胞具有肝细胞标志物HNF4α的表达，并具有良好的细胞间连接（ZO-1+）。

分化前后的小鼠肝类器官对比

图 6：分化前后小鼠肝类器官标志物表达水平对比

图 7：小鼠肝类器官分化前后的功能水平检测

如图 6 所示，小鼠肝类器官（mouse liver organoids, mLIO）分化前处于活跃增殖阶段，主要的细胞类型为肝祖细胞（KI67，AFP）和导管细胞（KRT19，SOX9），分化后（diff. mLIO）成熟肝细胞标志物（APOA1，ALB，ASS1，GLU1）显著上升；但相比于原代肝组织（Tissue，T），肝细胞代谢成熟度（CYP7A1，CYP2A1）不足，但相比于分化前的肝类器官仍有明显上升。

而谷草转氨酶（AST）和甘油三酯（TG）在分化前后的小鼠肝类器官的表达水平检测结果（图 7）显示，仅有分化后的肝类器官能够检测出阳性表达。因此，分化前的肝类器官更适用于进行长期的维持扩增及肝脏发育阶段研究，而分化后的肝类器官更适用于进行药物的肝毒性评价。

小鼠肝类器官分化前后药物毒性测试



图 8 ：吉西他滨、顺铂、多柔比星和替扎尼定给药小鼠分化前后肝类器官的剂量-反应曲线

如图 8 所示，与分化前肝类器官（mLIOs）相比，分化后的肝类器官（Diff. mLIOs）对吉西他滨、顺铂、多柔比星和替扎尼定等药物更为敏感，更适合进行化合物的肝毒性研究。