类器官构建及分化



MasterAim® hPSC-肝类器官分化试剂盒用于类器官构建过程示意图:

第一阶段（D0）：可见高核质比的iPSC/ES细胞紧密排列、且集落具有确定边界；

第二阶段（D3）：细胞从典型的干细胞克隆形态逐渐转变成为多边锐角的定向内胚层细胞形态；

第三阶段（D7）：细胞棱廓开始逐步变模糊；

第四阶段（D12）：此阶段细胞棱廓将逐步变得更规则，细胞内含物逐渐丰富，开始逐步转变为间隙清晰的上皮样细胞，此时分化过程中开始出现的空泡，并随时间增加逐步显著；

第五阶段（D19）: 可看到大部分细胞呈现出典型的肝祖细胞或肝细胞规则的多边形形态，且胞核清晰可见；

第六阶段（D26）: 此阶段肝祖细胞类器官有2种3D细胞形态出现。一是空泡状，空腔内由独特的肝样细胞排列组成；二是为实心状态；

第七阶段（D37）： P1-P2代后的肝祖细胞类器官以空泡状类器官为主；此阶段获得的类器官可传代、可冻存；

第八阶段（D42）：在分化的第15天，空泡状的肝类器官内部越来越多向黑色实质转变，整体上黑色实质状类器官团增多。

肝系分化阶段鉴定

分子鉴定



免疫荧光染色可见：分化第3天内胚层标志蛋白SOX17表达阳性，分化第9天肝祖细胞标志蛋白EPCAM表达阳性，分化第13天后肝细胞标志蛋白AFP/ALB表达阳性。

肝功能鉴定



分化第15天可见部分成熟肝细胞已具备吲哚氰绿（IGG）转运功能。

肝类器官鉴定

形态鉴定

组织鉴定

H&E染色可见：

肝祖细胞类器官可见排列整齐的单层细胞，呈空泡状，内部的肝细胞胞浆内有空泡出现，细胞核呈圆形或卵圆形、具有双核现象。分化后的肝类器官外层细胞增生变厚，囊壁内侧组织隆起或填充，双核细胞比例增加，并且腔内具有细胞和内容物。

分子鉴定

免疫荧光染色可见：成熟肝肝类器官表达AFP与ALB蛋白。

qPCR鉴定可见：多能性基因随分化进行表达降低；肝祖细胞与肝细胞标志基因在类器官中高表达。

肝功能鉴定

物质含量测定可见：成熟肝类器官具有尿素、白蛋白、总胆汁酸生成能力与谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性。

药物肝毒性测试

药物处理96 h后肝类器官活率曲线与IC50值

实验分别使用不同浓度的肝毒性药物（对乙酰氨基酚、丁螺环酮、利福平、酮康唑、波声坦、双氯芬酸钠）对肝类器官进行处理。

实验表明：肝类器官能够敏感地评价药物毒性，结果提示对乙酰氨基酚为低肝毒性药物（IC50 > 400 μM），丁螺环酮、利福平为中肝毒性药物（IC50介于100-400 μM之间），酮康唑、波声坦、双氯芬酸钠为高肝毒性药物（IC50 < 100 μM）。

肝疾病模型构建

非酒精性脂肪肝类器官体外模型构建与鉴定，油红或尼罗红染色可见细胞内脂滴驻留。



纤维化类器官体外模型构建与鉴定，α-SMA荧光标记可见纤维化细胞聚集于类器官内部。