血管类器官构建及分化

MasterAim® hPSC-血管类器官分化试剂盒用于类器官构建过程示意图:

第一阶段：血管谱系分化

D0：在干细胞培养基（自备）中，hiPSC/hESC呈贴壁克隆状形态；

D0~D1：试剂A诱导后，细胞形成正球型且大小均一的拟胚体；

D1~D4：试剂B诱导后，拟胚体逐渐向定向中胚层分化；

D4~D7：试剂C诱导后，中胚层逐渐发生内皮前体细胞等血管谱系分化。

第二阶段：血管网发生与血管类器官形成

D7~D16：试剂D诱导后，球状结构在3D细胞外基质中逐渐生成密集且发散状血管网；

D16~D18：试剂D诱导后，血管网脱离细胞外基质后逐渐收拢为球形成熟血管类器官；

D18~D32：试剂D维持诱导期间，可进行其他生物学与医学研究。

血管分化鉴定

组织鉴定

H&E染色结果显示，成熟血管类器官为实心球状结构，中心部位结构较为疏松，中心层至球边缘结构较为致密，细胞形态、结构与类型较为复杂，外表面可观察到条状或管状内皮细胞与周细胞。

功能鉴定

AB-PAS染色显示，成熟血管类器官的内皮细胞与周细胞具备糖蛋白合成功能。蓝色,细胞核；红色，中性糖蛋白。



Masson染色显示，成熟血管类器官富含α-SMA阳性周细胞与血管基底膜，并具备肌纤维生成与胶原分泌功能。蓝色，胶原蛋白；红色，肌纤维。

分子鉴定（mRNA检测）



qRT-PCR检测hESC细胞（D0）、定向中胚层细胞（D4）、血管聚集体（D7）和成熟血管类器官（D18）中特异性基因的表达。

第0天，hESC细胞高水平表达多能基因KLF4/OCT4/SOX2/NANOG/MYC。第4天，定向中胚层细胞表达中胚层标志基因HAND1。第18天，内皮细胞标志基因CD31、周细胞标志基因ACTA2/PDGFRB和基膜标志基因COL4A2的表达在血管类器官成熟过程中逐渐升高。

分子鉴定（蛋白检测）





免疫荧光检测血管类器官特征蛋白表达。

成熟血管类器官表达内皮细胞标志蛋白CD31/E-cadherin， 周细胞标志蛋白PDGFR-β/α-SMA， 基底膜标志蛋白Collagen IV。同时还可在血管网与血管类器官中观察到密集且网状分布的周细胞。