类器官构建及分化



MasterAim® hPSC-肠类器官分化试剂盒用于类器官构建过程示意图:

第一阶段：2D分化阶段

D0：在干细胞培养基（自备）中，hiPSC/hESC呈贴壁克隆状形态；

D0~D3：试剂A分化后，细胞逐渐转变成为多边锐角形的定向内胚层细胞；

D3~D8：试剂B分化后，细胞逐渐逸出边缘隆起且中间凹陷的柿饼状3D后肠球。

第二阶段：3D分化阶段

D8~D20：试剂C1分化后，后肠球逐渐扩增为空腔状球形肠类器官，可进行传代、冻存；

D20~D30：试剂C2分化后，空腔状肠类器官逐渐发生黑色实质转变；

D30~D40：试剂C2维持分化期间，可进行其他生物学与医学研究。



肠系分化鉴定

组织鉴定



H&E染色结果显示，肠类器官中心管腔与周围上皮细胞密切相互作用。周围的原始间质促进了高度复杂上皮结构的形成。

功能鉴定



AB-PAS染色结果显示，成熟类肠器官中的杯状细胞具备分泌糖蛋白功能。

分子鉴定（mRNA检测）



qRT-PCR检测hESC细胞、定向内胚层细胞、后肠球和成熟肠类器官特异性基因表达。

D0：在干细胞培养基中，hESC细胞高水平表达多能性基因OCT4/SOX2/NANOG/MYC/KLF4；

D3：试剂A分化完成后，定向内胚层细胞高水平表达内胚层标志基因SOX17/GATA4/FOXA2；

D9：试剂B分化完成后，后肠球高水平表达细胞生长基因CDX2/LGR5；

D25：试剂C分化成熟后，肠类器官表达各种细胞类型标记，如肠上皮细胞标志基因KRT20/PDX1/STAB2， cajal间质细胞标志基因VIM， 潘式细胞标志基因LYZ/MMP7，杯状细胞标志基因MUC2，肠干细胞标志基因LGR5/OLFM4和肠内分泌细胞标志基因CHGA。

分子鉴定（蛋白检测）



免疫荧光检测肠类器官特征蛋白表达。

成熟肠类器官表达肠上皮细胞标志蛋白E-cadherin/EpCAM/Villin1/KRT20， 间质细胞标志蛋白Vimentin， 潘式细胞标志蛋白Lysozyme，杯状细胞标志蛋白Mucin 2和肠内分泌细胞标志蛋白Chromogranin A。

药物肠毒性评价



实验分别使用不同浓度的药物（多柔比星、顺铂、小檗碱、乙酰水杨酸、布洛芬）对肠类器官进行48 h处理，通过ATP法测定细胞活率。

实验表明：多柔比星对肠类器官的IC50介于1~10 μM之间，顺铂、小檗碱对肠类器官的IC50介于10~100 μM之间，乙酰水杨酸、布洛芬对肠类器官的IC50均大于1000 μM。

道炎性凋亡模型构建

实验使用TNF-α（50 ng/mL）对肠类器官进行48 h处理，通过qPCR法测定凋亡相关基因表达。

实验表明：低剂量TNF-α诱导后，肠类器官未发生显著的细胞坏死现象，但可观察到凋亡基因Caspase-3/Caspase-8表达明

显上调。

肠道气-液交互模型构建



实验使用hPSC衍生的肠类器官作为细胞来源，通过接种至基质胶包被的Transwell小室中构建肠道气-液交互模型。

实验表明：hPSC衍生的肠类器官可以在Transwell小室中高效形成单层至多层类肠平面，可用于研究气-液交互模界面肠道生物学研究。