MasterAim®️hPSC-肝类器官分化试剂盒2.0（悬浮法）通过模拟体内肝脏谱系分化微环境，诱导人胚胎干细胞（hESC）或人可诱导多能干细胞（hiPSC）依次向定型内胚层、肝系内胚层、肝内胚层类器官与成熟肝细胞类器官分化。本试剂盒操作便捷，无需拟胚体形成、胶滴培养与抗黏附处理等步骤，一次标准的分化流程支持1*107个干细胞在28~30天收获1*103个成熟肝类器官，支持肝内胚层类器官长期传代培养与冻存。经本试剂盒构建的肝类器官，经过严格的形态学、组织学、分子生物学与细胞功能鉴定，可用于肝脏发育生物学、疾病模型构建、药物筛选、药理毒理、药物代谢等研究。
hPSC-肝脏类器官构建及分化
第一阶段：2D分化阶段
D0：在干细胞培养基（自备）中，hiPSC/hESC呈贴壁克隆状形态；
D0-D3：试剂A&B分化后，细胞逐渐转变成为多边锐角形的定向内胚层细胞；
D3-D8：试剂C分化后，细胞逐渐转变为间隙清晰的上皮样肝内胚层细胞。
第二阶段：3D分化阶段
D9~D24：试剂D分化后，细胞逐渐扩增为空腔状类球形肝内胚层类器官，可进行传代、冻存；
D24~D30：试剂E分化后，空腔状肝内胚层类器官逐渐发生黑色实质转变，变为成熟肝类器官；
D30~D37：试剂E维持培养期间，可进行其他生物学与医学研究。
hPSC-肝脏类器官鉴定
组织鉴定
H&E染色结果显示，肝内胚层类器官为单层薄壁空泡状结构，成熟肝类器官为内部为褶皱状上皮细胞样堆叠结构、间质样细胞填充结构与少量空腔结构。
AB-PAS染色结果显示，成熟肝器官具备分泌中性与酸性糖蛋白功能。
hPSC-肝脏类器官模型应用
肝脏发育生物学模型
hESC（D0）、肝内胚层类器官（D21）与成熟肝类器官（D32）的差异基因表达火山图，诱导肝成熟期间可见大量基因受到上调，显示基因转录活跃性。
样本主成分降维分析后可见hESC（D0）、肝内胚层类器官（D21）与成熟肝类器官（D32）的表达模式差异。
分化不同阶段hESC（D0）、肝内胚层类器官（D21）与成熟肝类器官（D32）样本的代表性差异基因与信号通路。
肝内胚层类器官（D21，右）与成熟肝类器官（D32，左）样本的代谢相关GSEA富集分析，显示成熟类器官肝脏物质合成与代谢功能得到明显提升。
自发型肝脏衰老模型
与正常肝类器官（D30）相比，自发型衰老肝类器官（D40）会出现更明显的胶原沉积现象、增殖标志物Ki-67表达减弱。
肝脏药物吸收模型
用25 μM与50 μM利福平处理成熟肝类器官24 h，并利用高精度LC-MS测定胞内药物积累情况，与空白组相比，利福平处理组胞内积累量均可提升至6.5倍。
药物肝代谢干预模型
用5 μM与10 μM酮康唑处理成熟肝类器官24 h，并利用高精度LC-MS测定细胞差异内小分子化合物，并对其进行聚类分析。
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