h-PSC背侧前脑类器官建模



第一阶段：2D分化阶段

D0：在干细胞培养基（自备）中，hiPSC/hESC维持典型贴壁克隆样形态，细胞边界清晰、克隆紧密，为后续类器官诱导提供稳定的起始状态；

第二阶段：早期诱导阶段

D0~D1：试剂A诱导后，干细胞逐渐脱离原始多能状态，进入早期分化启动阶段，细胞开始发生聚集与命运转变，为后续神经谱系诱导奠定基础。

第三阶段：神经前体诱导阶段

D1~D6：试剂B继续培养后，细胞进一步向神经外胚层/前脑神经前体方向分化，逐渐形成较为均一的早期类器官结构。此阶段类器官整体形态趋于规则，细胞增殖活跃，开始建立神经上皮样组织基础。

第四阶段：背侧前脑体扩增阶段

D6~D24：试剂C诱导后，类器官体积持续增大，边界逐渐清晰，内部可形成典型的神经上皮样花环/放射状结构。此阶段类器官以背侧前脑神经前体扩增为主，可检测到PAX6、SOX2等神经干/祖细胞相关标志物，提示类器官已成功建立背侧前脑样前体区域。

第五阶段：皮层神经元分化阶段

D24~D42：在试剂D作用下，类器官进一步向皮层神经元方向分化。随着培养推进，类器官内部神经元成分逐渐增加，可检测到TUJ1、MAP2等神经元相关标志物。

第六阶段：长期成熟与研究应用阶段

D42~D90+：在试剂E维持培养阶段，类器官进入长期成熟过程。随着培养时间延长，类器官可进一步出现胶质相关细胞及突触相关蛋白表达，如 GFAP、OLIG2、SYN1、PSD95等，提示其细胞组成和组织成熟度进一步提高。该阶段类器官可用于后续生物学与医学研究，包括脑发育、神经疾病建模、药物评价及功能机制分析等。

h-PSC背侧前脑类器官鉴定

1.背侧前脑神经前体建立

培养时间增加至D24，类器官中可见明显的 PAX6 阳性和 SOX2 阳性细胞，并形成典型的神经上皮样花环（rosette）结构。PAX6 和 SOX2 是早期神经干/祖细胞的重要标志物，其表达提示类器官已成功建立背侧前脑样神经前体区域。

2.背侧前脑分化方向明确

随着培养时间增加到D42，同样可观察到 PAX6/SOX2 阳性的神经上皮样结构，进一步说明本试剂盒诱可诱导稳定背侧前脑类器官。

3.皮层神经元分化

培养时间增加至D56，类器官中可检测到广泛的 TUJ1 阳性神经元信号，并可见 CTIP2 阳性细胞。TUJ1 为神经元标志物，CTIP2 为皮层深层神经元相关标志物，提示类器官已进一步分化产生皮层样神经元群体，符合背侧前脑类器官的发育特征。

4.神经前体与皮层神经元共存

培养时间增加至D63，类器官内同时存在 SOX2 阳性神经前体细胞和 TBR1 阳性早期皮层神经元。SOX2 代表未完全分化的神经前体状态，TBR1 为早期皮层投射神经元相关标志物，提示类器官在培养过程中保留一定发育连续性，并形成背侧前脑/皮层样细胞组成。

5.胶质细胞生成

培养时间增加至D120，类器官中可见 GFAP 阳性细胞及 OLIG2 阳性细胞。GFAP 为星形胶质细胞相关标志物，OLIG2 为少突胶质细胞谱系相关标志物，提示随着培养时间延长，类器官已进一步产生胶质相关细胞群体，反映出更丰富的神经系统细胞组成。

6.突触网络生成

培养时间增加至D120，类器官中可检测到 SYN1 和 PSD95 信号。SYN1 为突触前相关蛋白，PSD95 为突触后致密区相关蛋白，其表达提示类器官神经元间已具备突触相关结构基础，说明类器官进入更高阶段神经成熟过程。

7.高分辨MEA电信号检测

神经类器官的功能成熟度评价不能仅依赖形态和分子标志物检测，还需要进一步从电生理层面验证其神经活性和网络功能。本研究采用高分辨率微电极阵列（MEA）平台，对本试剂盒构建的背侧前脑类器官进行电信号检测。

结果显示，类器官中可检测到明确的自发性电活动，动作电位样信号振幅约为 30 μV，提示该试剂盒构建的背侧前脑类器官具备可量化的神经电生理活性。此外，不同类器官之间也可记录到神经网络样交流信号，进一步说明该模型具有用于神经网络功能评价的应用潜力。

该结果表明，本试剂盒构建的背侧前脑类器官不仅具有典型的结构和分子特征，还具备可被 MEA 平台捕捉和分析的功能性电活动，可为脑发育研究、神经疾病建模、药物筛选及神经毒性评价提供稳定的体外功能检测模型。